TuttoChimica.it

La cromatografia

Descrizione e caratteri generali della cromatografia

La cromatografia è una tecnica analitica che consente di separare dei componenti chimici (o biologici) trasportati da un fluido (liquido o gas) che passa attraverso una componente fissa che, interagendo con forze differenti per analiti differenti, ne permette la separazione.

Si dice FASE MOBILE il fluido (liquido o gas) che trasporta gli analiti.
Si dice FASE STAZIONARIA la fase fissa (solida o liquida).

Esistono vari tipi di cromatografia, a seconda della fase mobile e della fase stazionaria utilizzate. La cromatografia fu 'ideata' a inizio del 1900 dal russo Tswett. Lo studioso lavorava su pigmenti vegetali e, nel tentativo di separarli gli uni dagli altri, versò il succo del macerato delle piante da lui studiate in una colonna di vetro ripiena di CaCO₃ , bagnata con acqua e chiusa nella parte sottostante da un rubinetto. Aprendo il rubinetto, lo strato di succo colava per gravità verso il basso trascinato dall'acqua, che veniva ulteriormente versata dall'alto, e in questo modo gli analiti interagivano con la fase solida; scendendo lungo la colonna, si separarono tra loro varie bande colorate, ognuna dovuta ad un pigmento diverso che interagiva in maniera differente con la fase stazionaria di CaCO₃: il pigmento che si legava maggiormente alla resina era più trattenuto ed eluiva per ultimo, il pigmento meno trattenuto usciva per primo.

Al giorno d'oggi si utilizzano colonne più evolute e miniaturizzate, che terminano con un rivelatore in grado di determinare quando esce la sola fase mobile (segnale 0) e quando esce l'analita (picco cromatografico del rivelatore). Un esempio di rivelatore è il rivelatore UV, ma ne esistono molti diversi tipi. Il grafico che viene fornito dal rivelatore è detto cromatogramma (in genere riporta sulle ascisse il tempo e sulle ordinate il fattore di rivelazione, come l'assorbanza nel caso del rivelatore UV).

Parametri per determinare l'efficacia della separazione:

Quello che interessa maggiormente nel separare tra loro più analiti in una stessa miscela è che il picco cromatografico, all'uscita dell'analita dalla colonna, sia ben 'risolto' e 'separato', cioè esca con un picco stretto e ben separato dai picchi degli altri analiti.

Detto t₀ il tempo impiegato dall'analita ad eluire dalla colonna senza la fase stazionaria e t₁ il tempo che invece impiega, alla stessa velocità di flusso, ad eluire dalla colonna con fase stazionaria, definiamo RITENZIONE o COEFFICIENTE DI CAPACITA'   K:

K = ( t₁ - t₀ ) / t₀

Vale anche la stessa formula con i Volumi di ritenzione (cioè i volumi di fase mobile usciti dalla colonna al tempo t₁ e al tempo t₀)

K = ( V₁ - V₀ ) / V₀

K ha in genere un valore che varia tra 1 e 10: è 1 quando t₁ è doppio di t₀. Valori più elevati di 10 possono consentire buone separazioni, ma con grande tempo richiesto per l'analisi. K è molto utile perchè consente di confrontare l'analisi dello stesso analita su stessa fase mobile e stessa fase stazionaria ma su colonne diverse e a flussi differenti.

Il secondo parametro che dobbiamo considerare è la selettività/risoluzione tra due differenti analiti, cioè il rapporto tra i tempi di eluizione di due analiti (o tra i due volumi di eluizione).

Selettività/risoluzione = k₂  / k₁     =   ( V₂  - V₀) / (V₁ - V₀) =   ( T₂  - T₀) / (T₁ - T₀)

Separazione e risoluzione sono due cose differenti: ci indicano rispettivamente il primo quanto sono distanti i due picchi e il secondo la capacità di ottenere picchi non sovrapposti tra loro. Se due analiti eluiscono con tempo di eluizione molto simile, i due picchi saranno sovrapposti e non distinguibili i due analiti. Per migliorare la risoluzione si può agire o sulla ritenzione K dei due analiti (variando le due k si varieranno anche i due tempi di eluizione), oppure migliorando l'efficienza della nostra cromatografia, ottenendo due picchi più stretti che, anche senza cambiare il loro tempo di eluizione, non siano più sovrapposti.

Nella cromatografia come abbiamo detto si viene a creare una ripartizione dell'analita tra le due fasi, mobile e stazionaria: possiamo dividere la colonna in migliaia di piccoli 'piatti teorici' dove avvengono gli equilibri, e prima di passare al piatto successivo l'analita si ripartisce tra fase mobile e fase stazionaria.

Dalla forma di un picco si può ricavare il numero di piatti teorici N per quella cromatografia, che considera il volume di eluizione (V) e l'ampiezza del picco (W):

N = 16 (V₁/W)²    =   16 (T₁/W)²

Noto N, si può risalire all'altezza equivalente del piatto teorico (HETP). Detta L la lunghezza della colonna:

HETP = L / N

L'efficienza di una cromatografia dipende da svariati fattori. E' molto importante anzitutto la velocità di flusso: per velocità maggiori otteniamo un'uscita più rapida degli analiti e picchi in genere più stretti, ma gli analiti avranno meno tempo per separarsi tra loro in picchi ben risolti. Con velocità di flusso inferiori si rischia di avere un allargamento dei picchi per la diffusione degli analiti nella fase mobile. Importanti ai fini dell'efficienza della separazione cromatografica sono anche l'impaccamento della fase stazionaria e la dimensione, forma e porosità delle particelle della stessa, tutti fenomeni che influiscono sulla larghezza del picco. Se si ha una fase stazionaria impaccata male (cioè la fase stazionaria non è omogenea ma presenta zone meno compatte e zone più compatte) o di forma non omogenea si creano percorrsi multipli dell'analita che scende lungo la colonna, oppure zone dove l'analita tende a ristagnare, con conseguente aumento della larghezza di banda cromatografica.

Un allargamento del picco cromatografico indica una minore efficienza della cromatografia. N, il numero di piatti teorici, è legato all'efficienza: più grande è N, migliore sarà l'efficienza. Analogamente, inferiore è HETP e migliore sarà l'efficienza.

Quindi l'efficienza di una cromatografia è legata all'ampiezza dei picchi e dipende essenzialmente da fattori cinetici (velocità flusso, impaccamento, diffusione), che influiscono su HETP e N. La selettività/risoluzione invece dipende dai tempi di ritenzione degli analiti (e quindi da K) e perciò è legata alle interazioni chimiche che si hanno tra gli analiti e la fase stazionaria/fase mobile. Per modificare K si ricorre a modifiche di pH o di polarità della fase mobile, oppure variando la fase stazionaria.

La risoluzione/selettività di due picchi, che eluiscono a tempi T2 e T1 e hanno ampiezze di banda rispettivamente W2 e W1 può essere calcolata, oltre che dal rapporto tra le due K come visto prima, anche dalla formula:

R = 2 (t₂-t₁)/(W₁+W₂)