TuttoChimica.it

La cromatografia su colonna

Descrizione e caratteri della cromatografia su colonna

La cromatografia su colonna è una cromatografia che consente di lavorare quantità variabili di analiti, dai ml a quantità industriali enormi. Come visto nell'articolo sulla cromatografia, un aumento della lunghezza della colonna comporta una migliore efficienza della cromatografia. In alcuni csi, come nella gascromatografia (che utilizza fase mobile gassosa) si usano colonne anche di decine di metri di lunghezza. Bisogna però considerare che un aumento di lunghezza comporta anche un incremento della resistenza al flusso, per questo si tratta di trovare un giusto compromesso.

La colonna viene riempita di fase stazionaria versandola dentro, oppure si possono trovare in commercio colonne preimpaccate (questo vale specialmente per la HPLC). Importanti sono, al fine della efficienza ottimale:

1) la fase stazionaria, che sia impaccata in maniera omogenea, per evitare il formarsi di percorsi preferenziali all'interno della fase stazionaria o zone di ristagno per gli analiti, che allargherebbero l'ampiezza del picco cromatografico.

2) la fase stazionaria, che sia di forma omogenea, meglio se non porosa e di forma sferica. LE sfere infatti si impaccano bene e in modo regolare. Influisce anche la loro dimensione: idealmente sarebbero meglio sfere piccole, perchè aumenta a parità di volume di fase stazionaria la superficie di scambio; però resine sferiche troppo piccole si impaccano eccessivamente e il fluido non riesce più a passare, e si ottiene una eccessiva resistenza al flusso. Anche in questo caso è questione di trovare il giusto compromesso tra dimensioni delle sfere e efficienza.

3) la velocità di flusso, anche in questo caso si tratta di compromesso: un flusso lento consente l'equilibrio degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria e quindi di separarsi meglio, ma comporta anche un tempo di analisi elevato e il pericolo della diffusione degli analiti nella fase mobile, con conseguente maggiore ampiezza di banda. Esiste una relazione tra velocità di flusso e altezza del piatto teorico, e che tiene ocnto dei fattori quali la diffusione e il trasferimento di massa all'interno della fase mobile e stazionaria: l'equazione di Van Deemter

HETP= A+B/v+Cv

HETP: altezza dei piatti teorici
v =  velocità lineare della fase mobile
A : diffusione vorticosa (assente nella gscromatografia).
B : diffusione longitudinale
C : trasferimento di massa (cinetica di adsorbimento/desorbimento tra FS e FM)

4) il volume di campione è anch'esso una variabile importante: un volume eccessivo in una colonna stretta porta sin da subito un ampio picco cromatografico; questo si può risolvere utilizzando colonne più larghe.

La cromatografia su colonna può avere finalità preparative o analitiche. L'eluizione degli analiti può avvenire secondo due modalità:

ISOCRATICA, viene mantenuta sempre la stessa fase mobile

A GRADIENTE, nel tempo varia la fase mobile, per eluire meglio i componenti che escono per ultimi per esempio.

La fase mobile scende verso il basso spinta anche soltanto dalla gravità (nei sistemi a bassa contropressione), oppure con una pompa che spinge la fase mobile (si parla in questo caso di HPLC e di GC, cromatografia liquida ad alta pressione e gascromatografia).

Al termine della colonna, i lcampione viene raccolto o manualmente con provette, oppure usando sistemi automatizzati di raccolta delle frazioni i uscita. Nella prte finale della colonna inoltre si trova un rivelatore in grado di creare il cormatogramma degli analiti in uscita dalla colonna: il rivelatore più utilizzato è il rivelatore UV, che riporta nel cromatogramma sulle ascisse il tempo di ritenzione e sulle ordinate l'assorbanza. Il segnale dell'assorbanza viene azzerato usando come bianco la fase mobile.