TuttoChimica.it

Determinazione della concentrazione proteica totale di un campione

Metodo del biureto

Il Biureto è un’ammide che si ottiene per condensazione, a 180°C, di due  molecole di urea con l’eliminazione di una molecola di NH₃. Il biureto in soluzione alcalina forma con gli ioni Cu²⁺ un complesso di colore violetto (reazione del biureto).

È stato osservato che questa reazione non è specifica solo del biureto, ma gli ioni Cu²⁺, in ambiente basico, reagiscono con qualsiasi composto contenente almeno 2 gruppi CONH₂ , CH₂NH₂ o CSNH₂.

Poiché la reazione richiede la presenza di due gruppi CONH₂, questa è negativa con gli amminoacidi e con i dipeptidi mentre è positiva con i polipeptidi a partire dai tripeptidi, e quindi anche con le proteine.

Il Cu in soluzione alcalina però è instabile perché precipitano i sali di rame come Cu(OH)₂. Quindi per stabilizzare i sali di Cu, Weichselbaum (1950) propose un reattivo contenente tartrato di sodio e potassio (sale di Seignette) e KI per impedirne l’autoriduzione.

L’intensità del colore è proporzionale al numero di legami peptidici interessati nella reazione. L’intensità del colore prodotto dalla reazione è proporzionale quindi anche alla concentrazione delle proteine, che potrà essere valutata per via spettrofotometrica (il complesso assorbe a 540 nm). 

 

Preparazione del reattivo per il metodo del biureto

Sciogliere 1.5 g solfato di rame (II) e 6 g tartrato di sodio e potassio in 500 mL H₂O.

Aggiungervi 300 mL NaOH 10%.

Portare a volume a 1L con H₂O.

Aggiungere 1 g KI (serve per inibire la riduzione del rame.

Conservare in contenitore al buio (o avvolto nell’alluminio), scartare nel caso si osservi un precipitato scuro o rossastro.

 

Retta di taratura con spettrofotometro

Preparare 2 mL di soluzione 10 mg/mL di BSA (albumina di siero di bovino) in H₂O. Da questa preparare differenti concentrazioni secondo la seguente tabella:

 

Conc finale (mg/mL)	Volume BSA 10 mg/mL (μL)	Volume H2O (μL)
0	0	500
0.5	25	475
1.5	75	425
3.0	150	350
5.0	250	250
8.0	400	100
10.0	500	0

 

Settare lo spettrofotometro a 540 nm. Il bianco viene effettuato con la conc. 0, ponendo in cuvetta 100 μL H₂O + 500 μL reattivo biureto.

Misurare le Assorbanze delle varie concentrazioni: 100 μL diluizione BSA + 500 μL reattivo biureto, attendere 30 secondi e leggere l’Assorbanza.

 

Preparare una retta di taratura tra Assorbanza (y) e Conc. di BSA in mg/mL (x) tramite un foglio di calcolo Excel, con cui si può determinare l’equazione della retta di taratura y=mx+q interpolante i punti ottenuti.

 

Quantificazione del contenuto proteico dei campioni

Misurare l’assorbanza dei vari campioni preparando la cuvetta con 100 μL campione + 500 μL reattivo biureto, attendere 30 sec. mescolando leggermente prima della misura allo spettrofotometro.

 

Campioni per esempio di carne o pesce possono essere valutati pesando in una provetta circa 0,1 g (esattamente pesati) dell’omogeneizzato dell'alimento, aggiungendovi 1 mL SDS 10% e lasciando in estrazione per 1 ora. A quel punto centrifugare e valutare il solo sopranatante.

Per tali omogeneizzati, il bianco allo spettrofotometro va rifatto con 100 μL SDS 10% + 500 μL reattivo biureto.

 

Utilizzando la retta di taratura sarà possibile determinare le concentrazioni in mg/mL di proteine complessive nei campioni [x=(y-q)/m] considerando poi i vari fattori di diluizione utilizzati.